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Wako,蛋白磷酸化研究的預製膠

  • 型   號☁☁◕:192-17401
  • 價   格☁☁◕:
  • 更新時間☁☁◕:2022-06-03
  • 廠家性質☁☁◕:經銷商

蛋白磷酸化研究的預製膠SuperSep Phos-tag™₪◕▩₪,145-08221產品簡介☁☁◕:
產品品牌☁☁◕:Wako
產品名稱☁☁◕:蛋白磷酸化研究的預製膠SuperSep Phos-tag™
產品貨號☁☁◕:192-17401
產品規格☁☁◕:5塊
蛋白磷酸化研究的預製膠

蛋白磷酸化研究的預製膠SuperSep Phos-tag™₪◕▩₪,192-17401

蛋白磷酸化研究的預製膠SuperSep Phos-tag™₪◕▩₪,145-08221產品簡介☁☁◕:

產品品牌☁☁◕:Wako

產品名稱☁☁◕:蛋白磷酸化研究的預製膠SuperSep Phos-tag™

產品貨號☁☁◕:192-17401

產品規格☁☁◕:5塊

Wako,蛋白磷酸化研究的預製膠

SuperSep Phos-tag™ 是研究蛋白磷酸化的方法₪◕▩₪,無需特異性磷酸化抗體或者同位素標記◕₪╃•✘。


192-17401.jpg

◆SuperSep Phos-tag™

  Phos-tag™ 是一種預製膠₪◕▩₪,預先加入了 50 μmol/L 的 Phostag™ Acrylamide₪◕▩₪,開啟包裝即可直接使用◕₪╃•✘。預製膠中含有鋅作為金屬離子₪◕▩₪,在中心凝膠緩衝液中儲存穩定性很好₪◕▩₪,得到的帶條結果也很整齊◕₪╃•✘。

  磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白作為不同條帶分離◕₪╃•✘。

  分離後₪◕▩₪,膠可用於考馬斯亮藍染色₪◕▩₪,免疫印跡和質譜實驗◕₪╃•✘。

◆Phos-tag™ SDS-PAGE 的原理

192-17401+1.jpg

◆在 HighWire Search 上搜索到的論文數

192-17401+2.jpg

◆運用

利用 p35 的丙氨酸突變體確定 Cdk5 啟用 p35 的磷酸化位點

  p35 常見的磷酸化位點是 Ser8 和 Thr138◕₪╃•✘。但是 Ser8 和 Thr138 位點往往會發生丙氨酸突變₪◕▩₪,產生3種突變體(Ser8 突變體☁☁◕:S8A₪◕▩₪,Thr138 突變體☁☁◕:T138A₪◕▩₪,Ser8 和 Thr138 雙突變體☁☁◕:2A)◕₪╃•✘。這3種突變體▩☁│₪↟、野生型 p35▩☁│₪↟、Cdk5 和沒有激酶活性的 Cdk5 都來源於 COS-7 細胞◕₪╃•✘。這些細胞裂解液用Phos-tag™ SDS-PAGE 和 Western blotting 進行檢測(檢測抗體☁☁◕:p35 抗體)◕₪╃•✘。

192-17401+3.jpg

100 μM Phos-tag ™ 丙烯醯胺, 7.5% 聚丙烯醯胺凝膠

可明確磷酸化位點和條帶遷移率的關係◕↟₪✘!

- 泳道1(條帶 L2 和 L4)和泳道5(條帶 M1)☁☁◕:p35 在 Cdk5 的作用下發生了磷酸化;

- 泳道1(條帶 L2 和 L4)和泳道3(條帶 L2 和 L4)☁☁◕:在無激酶活性 Cdk5 的作用下₪◕▩₪,大約有一半 p35 蛋白在 Thr138 位點發生磷酸化₪◕▩₪,同樣在 138 位發生突變的 p35 蛋白亦是如此◕₪╃•✘。

- 泳道5 (條帶 M1)和泳道6(條帶 L3 和 L4)☁☁◕:Ser8 和 Thr138 是主要的磷酸化位點;

- 泳道5(條帶 M1)▩☁│₪↟、泳道7(條帶L1和L2)和泳道8(條帶M2)☁☁◕:條帶 M1 是 Ser8 和T hr138 都發生磷酸化的條帶;

條帶 M2 是隻有 Ser8 磷酸化的條帶;條帶 L1 和 L2 是隻有 Thr138 磷酸化的條帶◕₪╃•✘。

※ 條帶 L1 和 L3 中的X是不確定哪個位點發生磷酸化的條帶;

※ 條帶L4是非磷酸化的 p35 ◕₪╃•✘。

【參考文獻】

▪ Quantitative Measurement of in Vivo Phosphorylation States of Cdk5 Activator p35 by Phos-tag ™ SDS-PAGE. T. Hosokawa, T. Saito, A. Asada, K. Fukunaga, and S. Hisanaga,Mol. Cell. Proteomics, Jun 2010;9: 1133 - 1143.

【結果提供】

理化學研究所 腦科學綜合研究中心 迴路功能研究核心 記憶功能研究團隊 細川智永(Dr. T. Hosokawa)

首都大學東京 理工學研究科 生命科學專業 神經分子功能研究室 久永真市(Dr. S. Hisanaga)

檢測含有 Dnmt1 磷酸化激酶的片段

192-17401+4.jpg

我們可以確定在片段中含有目的激酶◕↟₪✘!

① 採用親和色譜法從鼠腦提取液中純化 GST-Dnmt1(1-290)結合蛋白

② 使用 0.3 M 和 1 M NaCl 的 DNA 纖維素柱洗脫得到目的蛋白

③ GST-Dnmt1(1-290)作為體外激酶實驗的反應底物

④ Phos-tag ™ SDS-PAGE 用於Western blotting₪◕▩₪,確定遷移條帶中每個片段的激酶活性

【參考文獻】

The DNA-binding activity of mouse DNA methyltransferase 1 is regulated by phosphorylation with casein kinase 1delta/epsilon. Y. Sugiyama, N. Hatano, N. Sueyoshi, I. Suetake, S. Tajima, E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, T. Koike, and I. Kameshita, Biochem. J., May 2010; 427(3): 489-97.

【結果提供】

高知大學 綜合研究中心 生命▩☁│₪↟、功能物質部門 實驗實習機器設施 杉山康憲(Dr. Y. Sugiyama)

香川大學 農學部 應用生物科學科 動物功能生化學研究室 龜下勇(Dr. I. Kameshita)

二維電泳中的應用☁☁◕:分析 hnRNP K 磷酸化異構體

  小鼠巨噬細胞 J774.1 經 LPS 刺激後₪◕▩₪,裂解細胞₪◕▩₪,經過免疫沉澱法分離得到 hnRNP K◕₪╃•✘。在二維電泳中₪◕▩₪,一維是 IPG 膠₪◕▩₪,二維是 Phos-tag ™ SDS-PAGE₪◕▩₪,可分離 hnRNP K 的異構體◕₪╃•✘。利用質譜儀₪◕▩₪,可以確認不同的點代表不同的亞型或修飾蛋白◕₪╃•✘。

192-17401+5.jpg

同一個等電點的位置上₪◕▩₪,不同位點發生磷酸化都可以被區分開來

(例: spots 6 vs. 8 and spots 4 vs. 7)

【參考文獻】

▪ Characterization of multiple alternative forms of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K by phosphate-affinity electrophoresis. Y. Kimura, K. Nagata, N Suzuki, R. Yokoyama, Y. Yamanaka, H. Kitamura, H. Hirano, and O. Ohara, Proteomics, Nov 2010; 10(21): 3884-95.

【結果提供】

橫濱市立大學 生命奈米系統科學研究科 生物體超分子系統科學專業 木村彌生(Dr. Y. Kimura)▩☁│₪↟、平野久(Dr. H. Hirano)

理化學研究所 RCAI 小原收

◆備註

樣品製備☁☁◕:

Phos-tag SDS-PAGE 對於蛋白樣品中的雜質非常敏感₪◕▩₪,尤其是螯合劑₪◕▩₪,釩酸₪◕▩₪,無機鹽₪◕▩₪,表面活性劑這類物質◕₪╃•✘。

強烈建議在 Phos-tag SDS-PAGE 之前透過 TCA 沉澱或滲析法降低雜質含量◕₪╃•✘。

轉膜前處理☁☁◕:

另一個必須的步驟是在轉膜前₪◕▩₪,用 EDTA 去除凝膠中的金屬離子(Mn2+ 或者Zn2+);該步驟可提高蛋白的轉膜效率◕₪╃•✘。

● 分別準備 10 mmol/L 含 EDTA 和不含 EDTA 兩種 1x transfer buffer◕₪╃•✘。

● 將凝膠浸泡在含 10 mmol/L EDTA 的 1x transfer buffer₪◕▩₪,至少 20 分鐘₪◕▩₪,溫和搖晃◕₪╃•✘。更換新緩衝液₪◕▩₪,重複3次◕₪╃•✘。

● 將凝膠浸泡在不含 10 mmol/L EDTA 的 1x transfer buffer₪◕▩₪,10 分鐘₪◕▩₪,溫和搖晃◕₪╃•✘。

● 轉膜操作*◕₪╃•✘。

* 建議用溼法轉膜₪◕▩₪,以提高轉膜效率◕₪╃•✘。

192-17401+6.jpg

◆質量控制

  每一批 SuperSep Phos-tag™₪◕▩₪,出廠前均根據其產品規格進行測試₪◕▩₪,以保證可分離磷酸化和非磷酸化蛋白₪◕▩₪,以及他們的分離成都在正常引數內◕₪╃•✘。

儲存溫度

2-10℃

◆產品資訊

用於 Bio-Rad 伯樂電泳儀

貨號

品名

電泳儀

規格

198-17981

SuperSep™ Phos-tag™ (50μmol/L), 7.5%, 17well,

83×100×3.9mm

Mini-PROTEAN®

Tetra Cell

(Bio-Rad Laboratories, Inc.)

5 塊

195-17991

SuperSep™ Phos-tag™ (50μmol/L), 12.5%, 17well,

83×100×3.9mm

5 塊

用於 Life Technologies 電泳儀

貨號

品名

電泳儀

規格

192-18001

SuperSep™ Phos-tag™ (50μmol/L), 7.5%, 17well,

100×100×6.6mm

XCell SureLock®

Mini-Cell

(Life Technologies, Inc.)

5 塊

199-18011

SuperSep™ Phos-tag™ (50μmol/L), 12.5%, 17well,

100×100×6.6mm

5 塊

用於 Wako EasySeperator 電泳儀

產品編號

產品

凝膠濃度

孔數

包裝

192-17401

SuperSep™ Phos-tag™ (50 μmol/L)
Phos-tag™ 預製膠50 μmol/L

6.0%

13孔

5塊

199-17391

6.0%

17孔

5塊

195-17371

7.5%

13孔

5塊

192-17381

7.5%

17孔

5塊

193-16711

10.0%

13孔

5塊

190-16721

10.0%

17孔

5塊

195-16391

12.5%

13孔

5塊

193-16571

12.5%

17孔

5塊

193-16691

15.0%

13孔

5塊

196-16701

15.0%

17孔

5塊

197-16851

17.5%

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SuperSep Phos-tag™ (50 μmol/L), 12.5%, 13 well

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Wako,196-16701

SuperSep Phos-tag™ (50 μmol/L), 15%, 17 well

Phos-tag 17

15%預製膠


5

Wako,197-16851

SuperSep Phos-tag™ (50 μmol/L), 17.5%, 13 well

Phos-tag 13

17.5%預製膠


5

Wako,194-16861

SuperSep Phos-tag™ (50 μmol/L), 17.5%, 17 well

Phos-tag 17

17.5%預製膠


5

Wako,蛋白磷酸化研究的預製膠


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